摘要
本文主要对枸杞黄酮类化合物的微波辐射辅助提取取枸杞粉末和提取最佳工艺进行研究。取得的主要研究成果如下：加入一定料液比(1：8、1：10、1：12)的水溶液，放入微波搅拌器中放置一定时间（40-min)，温度70-摄氏度之间，功率（-w）。取出过滤，取其溶液放置旋转蒸发仪中进行蒸馏。枸杞渣滓放回搅拌器中进行二次提取，提出多糖混合液醇沉冷冻干燥后，为褐色絮状粉末固体。确定最佳工艺：提取温度90℃；料水比1∶10(W∶V)，提取时间2h，功率。得出多糖再进行Sevage法脱蛋白，冷冻干燥后，为乳白色絮状粉末固体粗多糖。在最佳条件下枸杞粗多糖提取率可达12.23%。枸杞粗蛋白含量6.98%
关键词：微波搅拌，冷冻干燥，Sevage法脱蛋白，分离纯化
Abstract
Inthispaper,themainflavonoidsofLyciumbarbarumsthemicrowave-assistedextractionofradiationfromwolfberryextractpowderandthebesttechnologyforresearch.Themainresearchresultsobtainedareasfollows:byaddingsomeliquidratio(1:8,1:10,1:12)aqueoussolutionintothemicrowavestirrerplacedaperiodoftime(40-min),thetemperaturebetween70-degreesCelsius,power(-w).Removethefilter,selectthesolutionplacedinRotaryEvaporatordistillation.Barbarumwastebackintotheblenderinthesecondextract,thepolysaccharidemixtureoffreeze-dryingalcohol,inordertobrownflocculentsolidpowder.Todeterminetheoptimumprocess:extractiontemperature90℃;feedwaterratio1:10(W:V),extractiontime2h,Power.PolysaccharidederivedfromanotherproteinSevagelaw,afterfreeze-dryingforwhiteflocculentpowderPolysaccharidesolid.UnderthebestconditionsinbarbarumPolysaccharideextractionrateof12.23%.Barbarum6.98%crudeproteincontent.
KEYWORDS:microwavemixing,freeze-drying,Sevagemethodofremovingprotein,purification
1.前言
枸杞中的化学成分比较复杂，主要包括蛋白质、氨基酸、微量元素、糖类、脂肪、脂肪酸、菇类、甾醇类、维生素、色素类、生物碱类。
枸杞多糖（LBP)是枸杞有效成分之一，是植物多糖中少有的含蛋白质多糖。从枸杞中分离得到的枸杞多糖，有六种已碳糖（鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖）组成的多糖侧链和18种氨基酸组成的蛋白质主链，以Glycan-O-Der方式连接，这种糖蛋白具有生物活性，是一种高强度的免疫增强剂。枸杞多糖一般作为保健食品的原料，可提高人体免疫力，增强造血功能，保肝降压，增强细胞活性，在医药、保健食品等领域应用广泛。
2.枸杞多糖提取原理
微波（microwave，MW）是波长介于1mm～1m（频率介于3×～3×Hz）的电磁波，微波辅助提取是利用微波能来提高提取率的一种新技术。微波在传输过程中遇到不同的会依物料性质不同而产生反射、穿透、吸收现象。在快速振动的微波电磁场中，微波辐射的极性物质分子吸收电磁能，以每秒数十亿次的高速振动产生热能。微波提取过程中，微波辐射导致植物细胞内的极性物质，尤其是水分子吸收微波能，产生大量的热，使细胞内温度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破，形成微小的孔洞；进一步加热，导致细胞内部和细胞壁水分减少，细胞收缩，表面出现裂纹。孔洞和裂纹的存在使胞外溶剂容易进入细胞内，溶解并释放出胞内产物。由于微波加热的热效率很高，升温速度快而且均匀，故显著的缩短了萃取时间，提高了萃取效率。常规的索氏萃取通常需要12～24小时才能处理一个样品，并且需要消耗上百升溶剂，而微波萃取可以将萃取时间缩短到半小时以内，有机溶剂的消耗量可以降至50mL以下。
萃取是有机化学实验室中用来提取和纯化化合物的手段之一。通过萃取，能从固体或液体混合物提取出所需的化合物。它的基本原理是利用化合物在两种不相溶（或微溶）的溶剂中溶解度或分配系数的不同，使化合物从一种溶剂内转移到另一种溶剂中。经过反复的多次萃取，将绝大部分的化合物提取出来。萃取常见的有液-液萃取和液-固萃取。在本次实验中，是利用水溶液从提过色素、黄酮的枸杞子粉末中提取出多糖类化合物，属于液-固萃取。
在微波条件下进行多糖类化合物的溶剂提取，溶剂的选择是根据原料中被提成分，即多糖类化合物的极性、共存杂质的理化特性，遵循相似相溶的原则，使有效成分从原料固体表面或组织内部向溶剂中转移的传质过程。一般而言，分子的极性依据活性基团的种类和数目、分子的缔合程度大小进行判断，分子中含有羟基或羧基基团越多，极性就越大，亲水性就越强；反之极性就越小，亲脂性越强。要把存在于植物细胞中各种水溶性多糖完全地提取出来,一般要求将试样尽可能地粉碎。根据枸杞果实细胞的特点及其含有大量的还原糖(40%～50%)不宜粉碎等情况,采用了机械成浆或剪碎成细粒后再行提取。
2.2提取流程的选择
从所发表的枸杞多糖研究文章中，多糖提取流程的主要差别一种是考虑到植物细胞组织外多有脂质包围，要使多糖释放出来，第一步就是用有机溶剂回流先除去试样表面脂肪，再用80%的乙醇回流提出单糖、低聚糖、甙类等干扰成分，然后用热水提取其中的多糖成分，把水液浓缩后用乙醇沉淀出多糖。另一种，直接用热水提取，离心除去水不溶性杂质，把水液浓缩后加乙醇沉淀出多糖使大量其它水溶性杂质分离。我们对上述两种提取流程做了对比实验后得出：(1)两种流程最终多糖的得率相近；(2)由于枸杞子热水浸出物成分多、含量高(60%以上)，直接用热水提取的溶液浓度高、粘度大，给离心分离水不溶性杂质和浓缩溶液的操作带来一定困难，乙醇沉淀多糖中吸附的单糖等水溶性杂质多，故需反复多次沉淀；(3)先用80%乙醇回流除去单糖等水溶性杂质后，再用热水提取的多糖溶液杂质少易浓缩，经乙醇沉淀的多糖纯度也高，再重复沉淀一次即可。但是，枸杞多糖既是以糖肽复合物为主，用热的有机溶剂脱脂和在高浓度的乙醇液回流过程中，很易引起糖复合物结构的不可逆变化而影响其生物活性，也可能是纯制的多糖活性不高的原因所在。所以，本实验研究直接用热水提取。
2.3脱蛋白
常用的去除多糖中蛋白质的方法有：Sevage法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法，这些方法的原理是使多糖不沉淀而使蛋白质沉淀。从资料知，枸杞子水溶性蛋白质为1.54%，这些蛋白质无论是游离态或以糖肽结合态进入热水中，在沉淀多糖的浓乙醇溶液中均被沉淀下来。为了除去能与多糖一起沉淀的游离蛋白质，许多人在提取分离流程中采用了Sevage法脱蛋白质手续。Sevage方法脱蛋白效果较好，它是用氯仿：戊醇或丁醇，以4：1比例混合，加到样品中振摇，使样品中的蛋白质变性成不溶状态，用离心法除去。
Sevage法：利用蛋白质在三氯乙烷等有机溶剂中变性的特点，将提取液与Sevage试剂[氯仿：正丁醇=5：1（V/V）]5：1混合，振荡，离心，变性后的蛋白质介于提取液与Sevage试剂交界处。此法的优点是条件温和，不会引起多糖的变性。
2.4乙醇沉淀多糖的适宜浓度
要使枸杞多糖完全地沉淀出来，并尽量减少对杂质的吸附，待沉淀的多糖浓缩液中多糖含量及用乙醇沉淀时在全部溶液中乙醇的最终浓度都要适度。为此，根据已知资料和我们的实验数据，待沉淀液中多糖含量在2%以下为宜，即g枸杞子经有机溶剂脱脂和用80%乙醇回流提取单糖等杂质后，再用热水提取多糖并将此溶液浓缩到ml即可。当用95%乙醇沉淀时，加入ml后开始出现沉淀(此时乙醇浓度为47.5%)，在充分搅拌的同时，继续加乙醇到上清液不再产生沉淀为止，共加入95%乙醇0ml(即乙醇的最终浓度为76%)。因此，在80%乙醇浓度下，枸杞多糖可完全地沉淀出来。但是，在用热水直接提取法中，由于提取液中水溶性成分多，杂质浓度大且不易浓缩，沉淀液体积大一些为好，这样再用乙醇沉淀出多糖时，可减少对单糖等杂质的吸附作用。另外，用乙醇反复多次进行沉淀，当加入乙醇到80%浓度后还不出现沉淀时，向沉淀液中加入少量(最终浓度为1%～2%)的醋酸钠，以提高溶液的离子强度，放置后多糖即凝聚而沉淀。所以，本实验研究直接用80%乙醇溶液提取。
3.实验方法
3.1枸杞粗多糖的提取
定量称取干燥的枸杞子2包，打浆机粉碎，加入一定料液比(1：8、1：10、1：12)的水溶液，放入微波搅拌器中放置一定时间（40-min)，温度70-摄氏度之间，功率（-w，过滤，得滤渣，再加入一定料液比(1：8、1：10、1：12)的水溶液，放入微波搅拌器中放置一定时间（40-min)，温度70-摄氏度之间，功率（-w），合并滤液，采用旋转蒸发器真空浓缩，得到的浓缩物用乙醇(乙醇终浓度大于80%)沉淀，滤布过滤，得滤渣用丙酮。石油醚混合液(体积比1：1)于50～60℃回流0.5h，滤布过滤，得沉淀，真空干燥1h，继续烘干，得到枸杞粗多糖。
3.2Sevage法脱蛋白
取一定量的粗多糖，加蒸馏水完全溶解，使其浓度约为mg/mL，用Sevage法脱蛋白，按枸杞多糖水溶液体积的20%加入三氯甲烷，再加入三氯甲烷体积的20%的正丁醇，剧烈振摇20min，使其充分混匀，0r/min离心，倾出上清液，除去中间变性蛋白和下层三氯甲烷，重复以上操作直至中间层无变性蛋白，得到脱蛋白多糖。
3.3提取工艺的优化
由于各因素之间相互交叉影响，因此为全面考虑提取多糖的工艺参数，在单因素实验基础上进行正交实验设计。通过单因素试验和正交试验法优化出提取枸杞多糖的最佳工艺条件为：提取温度90℃；料水比1∶10(W∶V)，提取时间2h，功率w。
4.实验结果
4.1精制枸杞多糖的得率
g干燥的枸杞子，按前面所述方法提取、脱去蛋白并纯化，得到精制枸杞多糖5.53g，得率为2.21%（W/W）。
枸杞多糖得率（%）=枸杞多糖(g)/枸杞子(g)
4.2蛋白质含量
将提取液与Sevage试剂[氯仿：正丁醇=5：1（V/V）]5：1混合，振荡，离心，变性后的蛋白质介于提取液与Sevage试剂交界处。将粗蛋白放入真空干燥箱中干燥，得黄色蛋白干燥物。
枸杞蛋白含量（%）=枸杞粗蛋白(g)/枸杞子(g)
经检测，精制枸杞多糖中蛋白质含量为6.98%。
5.结论
原料用热水浸提法提取LBP，研究浸提时间、温度、料水比、浸提次数以及微波、超声波两种与处理方法对多糖的的率的影响：同时研究醇沉时间和醇沉是乙醇加入量对多糖的率的影响。得出：
（1）经试验论证，本实验采用微波加热的方法，提枸杞多糖。
（2）最佳工艺的确定：在微波辅助条件下，进行溶剂、固液比、微波功率、加热时间和加热温度五组单因素实验，通过数据的对比，确定以固液比、微波功率、加热时间、加热温度为四因数的四因数三水平的正交实验。枸杞多糖是一种具有多种生物活性多糖，利用多糖易溶于水的性质，以水为溶剂提取枸杞多糖可取得较好效果。研究表明提取温度、料水比、提取时间等因素对提取率均有较大的影响，其影响效果的主次顺序是：提取温度料液提取时间。通过单因素试验和正交试验法优化出提取枸杞多糖的最佳工艺条件为：提取温度90℃；料水比1∶10(W∶V)，提取时间2h，功率w。
（3）在最佳条件下枸杞粗多糖提取率可达12.23%。枸杞粗蛋白含量6.98%。
参考文献
[1]张惟杰.糖复合物生化研究技术(第2版)[J].杭州：浙江大学出版社.
[2]韩雅珊.食品化学实验指导[M].北京：北京农业大学出版社，，57-58
第一部分：野生灵芝菌种的分离、扶壮、保藏和培养
前言
采集吉林长白山野生灵芝，经过菌种分离，鉴定为GANODERMA（英文名称）多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(Leyss.exFr.)Karst．的菌种。经过纯化扶壮培养，成为一支优良的灵芝菌种，为灵芝菌丝体发酵培养和灵芝多糖的提取奠定了基础。
实验室流程：（百级净化超净工作台)菌种分离菌种接种（恒温培养箱）菌种培养扶壮（恒温恒湿冷藏柜）优良菌种保藏（百级净化超净工作台)菌种分离菌种接种（摇床）发酵菌种摇瓶培养（用于接种菌种罐）
第二部分：灵芝菌丝体液体发酵培养
前言
液体发酵培养不同于灵芝子实体栽培，周期短，产量高，无污染，灵芝多糖含量高，节省木材和耕地。是一种灵芝多糖理想的工厂化现代科技生产方式。经过摇瓶培养的灵芝菌种接种于种子罐，待生长良好，在接种于扩大的发酵罐中，通过通气恒温培养，长成成年灵芝菌丝体，生长完全后，进行离心分离喷雾干燥，就得到相当于灵芝子实体的灵芝菌丝体粉，多糖含量达到15%左右。进一步提取加工得到高含量的灵芝多糖。
灵芝菌丝体发酵工艺流程:（配料罐）培养液的配制（菌种罐）菌种的发酵培养
（发酵罐）灵芝菌丝体发酵培养（离心机）灵芝菌丝体固液分离
（浓缩液配制罐)灵芝菌丝体配制成浓缩液（喷雾干燥塔）浓缩液喷雾干燥，得到灵芝菌丝体粉
第三部分：灵芝菌丝体多糖的提取分离
前言
灵芝菌丝体粉，是大部分不溶解于水，食用以后象灵芝子实体一样，只有少部分成分被吸收，通过现代提取手段，将灵芝菌丝体经过提取罐的水提取，经过真空浓缩，在经过醇沉工艺，加工成可以全部被人体吸收，灵芝多糖含量提高到30-40%灵芝菌丝体提取物。极大的提高了功效，减少了服用量。
灵芝多糖提取工艺流程：(提取罐）灵芝菌丝体粉水提取（外循环真空浓缩罐）提取液真空浓缩（醇沉罐）浓缩液乙醇沉淀多糖（离心机）沉淀多糖分离
(浓缩液储罐）沉淀物配制成多糖浓缩液（喷雾干燥塔）灵芝多糖喷雾干燥
（粉碎机）灵芝多糖粉碎到目（混合机）灵芝多糖粉批量混合（真空包装机）食品塑袋真空包装。灵芝多糖原料成品
第一部分：野生灵芝菌种的分离、扶壮、保藏和培养
前言
采集吉林长白山野生灵芝，经过菌种分离，鉴定为GANODERMA（英文名称）多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(Leyss.exFr.)Karst．的菌种。经过纯化扶壮培养，成为一支优良的灵芝菌种，为灵芝菌丝体发酵培养和灵芝多糖的提取奠定了基础。
实验室流程：（百级净化超净工作台)菌种分离菌种接种（恒温培养箱）菌种培养扶壮（恒温恒湿冷藏柜）优良菌种保藏（百级净化超净工作台)菌种分离菌种接种（摇床）发酵菌种摇瓶培养（用于接种菌种罐）
第二部分：灵芝菌丝体液体发酵培养
前言
液体发酵培养不同于灵芝子实体栽培，周期短，产量高，无污染，灵芝多糖含量高，节省木材和耕地。是一种灵芝多糖理想的工厂化现代科技生产方式。经过摇瓶培养的灵芝菌种接种于种子罐，待生长良好，在接种于扩大的发酵罐中，通过通气恒温培养，长成成年灵芝菌丝体，生长完全后，进行离心分离喷雾干燥，就得到相当于灵芝子实体的灵芝菌丝体粉，多糖含量达到15%左右。进一步提取加工得到高含量的灵芝多糖。
灵芝菌丝体发酵工艺流程:（配料罐）培养液的配制（菌种罐）菌种的发酵培养
（发酵罐）灵芝菌丝体发酵培养（离心机）灵芝菌丝体固液分离
（浓缩液配制罐)灵芝菌丝体配制成浓缩液（喷雾干燥塔）浓缩液喷雾干燥，得到灵芝菌丝体粉
第三部分：灵芝菌丝体多糖的提取分离
前言
灵芝菌丝体粉，是大部分不溶解于水，食用以后象灵芝子实体一样，只有少部分成分被吸收，通过现代提取手段，将灵芝菌丝体经过提取罐的水提取，经过真空浓缩，在经过醇沉工艺，加工成可以全部被人体吸收，灵芝多糖含量提高到30-40%灵芝菌丝体提取物。极大的提高了功效，减少了服用量。
灵芝多糖提取工艺流程：(提取罐）灵芝菌丝体粉水提取（外循环真空浓缩罐）提取液真空浓缩（醇沉罐）浓缩液乙醇沉淀多糖（离心机）沉淀多糖分离
(浓缩液储罐）沉淀物配制成多糖浓缩液（喷雾干燥塔）灵芝多糖喷雾干燥
（粉碎机）灵芝多糖粉碎到目（混合机）灵芝多糖粉批量混合（真空包装机）食品塑袋真空包装。灵芝多糖原料成品
第一部分：野生灵芝菌种的分离、扶壮、保藏和培养
前言
采集吉林长白山野生灵芝，经过菌种分离，鉴定为GANODERMA（英文名称）多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(Leyss.exFr.)Karst．的菌种。经过纯化扶壮培养，成为一支优良的灵芝菌种，为灵芝菌丝体发酵培养和灵芝多糖的提取奠定了基础。
实验室流程：（百级净化超净工作台)菌种分离菌种接种（恒温培养箱）菌种培养扶壮（恒温恒湿冷藏柜）优良菌种保藏（百级净化超净工作台)菌种分离菌种接种（摇床）发酵菌种摇瓶培养（用于接种菌种罐）
第二部分：灵芝菌丝体液体发酵培养
前言
液体发酵培养不同于灵芝子实体栽培，周期短，产量高，无污染，灵芝多糖含量高，节省木材和耕地。是一种灵芝多糖理想的工厂化现代科技生产方式。经过摇瓶培养的灵芝菌种接种于种子罐，待生长良好，在接种于扩大的发酵罐中，通过通气恒温培养，长成成年灵芝菌丝体，生长完全后，进行离心分离喷雾干燥，就得到相当于灵芝子实体的灵芝菌丝体粉，多糖含量达到15%左右。进一步提取加工得到高含量的灵芝多糖。
灵芝菌丝体发酵工艺流程:（配料罐）培养液的配制（菌种罐）菌种的发酵培养
（发酵罐）灵芝菌丝体发酵培养（离心机）灵芝菌丝体固液分离
（浓缩液配制罐)灵芝菌丝体配制成浓缩液（喷雾干燥塔）浓缩液喷雾干燥，得到灵芝菌丝体粉
第三部分：灵芝菌丝体多糖的提取分离
前言
灵芝菌丝体粉，是大部分不溶解于水，食用以后象灵芝子实体一样，只有少部分成分被吸收，通过现代提取手段，将灵芝菌丝体经过提取罐的水提取，经过真空浓缩，在经过醇沉工艺，加工成可以全部被人体吸收，灵芝多糖含量提高到30-40%灵芝菌丝体提取物。极大的提高了功效，减少了服用量。
灵芝多糖提取工艺流程：(提取罐）灵芝菌丝体粉水提取（外循环真空浓缩罐）提取液真空浓缩（醇沉罐）浓缩液乙醇沉淀多糖（离心机）沉淀多糖分离
(浓缩液储罐）沉淀物配制成多糖浓缩液（喷雾干燥塔）灵芝多糖喷雾干燥
（粉碎机）灵芝多糖粉碎到目（混合机）灵芝多糖粉批量混合（真空包装机）食品塑袋真空包装。灵芝多糖原料成品
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